Co je gelová elektroforéza?

Gelová elektroforéza je metoda oddělování, identifikaci a charakterizaci směsi proteinů, nukleových kyselin. Denaturované vzorky migraci po aplikaci elektřiny v tenké, vlhké gelu obvykle vyrobené z polyakrylamidu nebo agarózy. Oddělené vzorky jsou zbarveny tak oni mohou být viděni. Gelová elektroforéza se používá bílkovin a nukleových kyselin a výzkumu v nemocnicích pro identifikaci neobvyklých proteinů nebo DNA vzory pro účely diagnózy chorob, genetických vad a genetických vztahů. Příprava vzorku

je detergent, jako je sodný dodecylsulfonate (SDS), přidá k proteinu nebo nukleové kyseliny, se detergent spojovat se a rozvinout (denaturovaný) proteinů a nukleových kyselin. Denaturace bílkovin usnadňuje určit jejich molekulovou hmotnost v elektroforéze. Množství vzorku potřebné, je obvykle 100 až 500 ng na zóny vzorku pro proteiny a od 5 do 100 ng na pásmo pro nukleové kyseliny v celkovém objemu asi 25 až 40 mikrolitrů.
Gely

gel, typicky vyrobený z polyakrylamidu nebo agarózy, může být připraven, nebo zakoupit oddělit tyto proteiny. Gel je hodně jako želatiny. To je většinou voda, ale je dostatečně pevná pro manipulaci. Gely obsahují pufr pro kontrolu pH. Gel je velmi tenká (1 až 2 mm) a obdélníkové. Jedna strana vypadá jako hřeben s mnoha chybějících zubů. Mezery se nazývají studny.
Sample Loading
fotografie

místa gel v komoře s pufrem a denaturované bílkoviny jsou přidány do jamek. Vzorky se známou molekulovou hmotností jsou přidány do vnější jamek. Gely jsou vyráběny s různým množstvím polyakrylamidu. Nízká pevnost gelu (4 procenta), je lepší pro separaci s vysokou molekulovou hmotností molekuly, zatímco vyšší pevnost gelu (12 procent), se používá pro vyšší molekulovou hmotností molekul. Gradientu se mění v pevnost gelu a oddělení celou řadu proteinů se ztrátou některých řešení.
Electromigration

Při použití s ​​vysokým elektrickým napětím, denaturované proteiny pohybovat směrem ke spodní části vrtu. Čím vyšší je hmotnost proteinu, tím pomaleji se pohybuje. Pokud je elektřina vypnuta, bílkoviny zastaví. Jeden odstraní gel z komory a kamení ho v misce s barvivem. Organická barviva jako Coomassie modré nebo kovových barviva se používají pro barvení proteinů při fluorescenční barviva jako ethidium bromidu se používají pro nukleových kyselin.
Analýza výsledků

Po odstranění přebytečného skvrna, je vidět, že směs se rozdělí na skupiny, které vypadají jako žebříky. Poloha pásem je v porovnání s přepravní vzdálenosti normami pro stanovení molekulové hmotnosti vzorku v každém pásmu. Gel může být dehydrovaný s alkoholem a vysuší tak, aby mohl být uložen. Intenzita barvy ze skupiny pak mohou být měřeny za účelem stanovení koncentrace proteinu v každém pásmu.
Vývoj protokolu
protokoly

Standardní jsou k dispozici pro práci s i- známé proteiny. Pokud výzkumník pracuje s neznámým vzorkem, pevnost gelu, typ bufferu může pufr pH, napětí, dobu spuštění a skvrna všechny musí být optimalizován pro dosažení nejlepší separaci a signál.
Protokoly