Cell Surface Biotinylace Protocol

Biotinylace využívá schopnost rozpustný vitamin biotin vázat na buněčné proteiny. Biotin se váže na protein strepavidin a je proto vhodné v buněčné biologii vizualizovat buněčné proteiny. Biotinylace umožňuje bezpečné značení proteinů ve srovnání s technikami, jako je radioaktivity a nemá vliv na buňky normální funkci. To umožňuje výzkumníkům studovat buněčné bílkoviny takový jako receptory, a to umožňuje lépe pochopit onemocnění a onemocnění procesů. Označení pozastaveno buněk

buňky

umýt v ledově studené fosfátovým pufrem (PBS) k odstranění znečišťujících látek. Pufry obsahující tris a glycin bude soutěžit s biotinylaci a je třeba se vyhnout. Aby se zabránilo biotinylating vnitřní proteiny, může být označení provedeno na 4 ° C a ° v přítomnosti azidu. Ponořte buňky v PBS a rozpustné biotinu, sulfo-NHS-LC-biotin.
Označení přívrženec buněk

buňky

umýt v PBS a inkubují s výrobkem, jako je sulfo -NHS-LC-biotinu. Buňky jsou poté škrabal do misky a lyžují v pufru obsahujícím detergent Triton-X 100 a připraveny pro vizualizaci.
Příprava označené buňky

Po inkubace se buňky odstředí na pelety a promyty v PBS. Buňky jsou resuspendovány v PBS a čištěné s gelem IgG sepharose. Vázaný protein se rozpustí v pufru a zahřeje na 100 stupňů Celsia.
Vizualizace buněk

Zředěný bílkoviny lze vizualizovat pomocí hmotnostní dodecyl sulfátu sodného v polyakrylamidovém gelu elektroforézou (SDS- PAGE) a poté blotting s proteinem a Enzyme Mix, streptavidin-křen peroxidu. Skvrny jsou zobrazeny s chemickou reakcí --- chemiluminiscence --- který vyzařuje světlo. Specifičnost biotinylace může být potvrzeno s protilátkami pro protein v rámci studie.