Jak měřit NADH

NAD a NADH jsou oba nukleotidy pyridin podílejí na metabolismu. NADH a NAD jsou co-enzym v mitochondriích, je powerhouses těchto buněk. Oba NAD a NADH se účastní buněčných reakcí, jako je dýchání a fotosyntéza, kde se vytvářejí energie a vodík. NAD a NADH paliva biochemické reakce, které vyžadují řadu enzymů k produkci ATP, hlavní zdroj energie v buňkách. To, co budete potřebovat
buňky nebo tkáně pod studijním
NADH Souprava testu
PBS
suchým ledem
Tepelný blok
96 jamková destička
Centrifuga popsané
trubky
destiček
Vortex
známý koncentrace NADH
Zobrazit další instrukce
testu
1

umyjte buňky nebo tkáně pod studie s chladnou fosfátu -pufru, PBS. Extrakt buněk nebo rozdělit tkáň v extrakčním pufru tím, že se směs na suchém ledu po dobu 20 minut a pak při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Opakujte.
2

míchejte 10 sekund. Spin v centrifuze po dobu 5 minut do buňky pelety nebo tkáně nečistoty. Odstraňte supernatant, kapalná fáze a umístěte kapaliny v čisté zkumavky.
3

Filtr supernatant prostřednictvím specializovaného filtr pro odstranění enzymy, které se členění NADH.
4

Odebrat 200 mikro litrů, umístěte do čisté zkumavky a tepla na 60 stupňů Celsia v termobloku po dobu 30 minut aby došlo k denaturaci NAD. Ochladí se a odstředí a odstraňte kapalnou fázi. Převod 50 mikro l do 96-jamkové destičky, každý vzorek musí být ve dvou nebo třech vyhotoveních. Chcete-li zjistit celkové NAD, NADt, nezahřívejte.
5

připravit a přidat cyklistické mix na 96-jamkové destičce. Promíchejte a inkubujte po dobu 5 minut. Přidat mikro 10 litrů vývojáře a nechat inkubovat při pokojové teplotě po dobu až 4 hodin. Přidat stop řešení. Přečtěte si změnu barvy na desce čtečky nebo fluorimetr v závislosti na sadě.
Standardní křivkou a výpočet
6

Připravte si standardní křivku tím, že známý koncentrace NADH a zředění v extrakčním pufru. Se zředí na různých koncentracích, zajištění koncové objem je stejný jako zkušební vzorky. Desky na stejné 96-jamkové destičky, jako zkušební vzorky. Odečtení extinkce.
7

remízy standardní křivka grafu se zaměřením na ose X a optické hustoty na ose y. Vezměte v průměru každého testovaného vzorku a přečtěte koncentrace z kalibrační křivky grafu.
8

Spočítejte NAD /NADH poměr odečtením celkového NAD, NADt, z NADH a dělení NADH.