Kryokonzervace Postupy

Kryokonzervace postupy jsou ty, které umožňují buňky, které mají být uloženy na dobu neurčitou pomocí extrémně nízkých teplot pozastavit metabolické aktivity. Existují dva hlavní typy kryoprezervačních řízení: rovnováha (konvenční pomalé tuhnutí) a nerovnovážné nebo ultra-rychlé zmrazení (vitrifikace). Termín vitrification pochází z latinského "skelný" nebo skelný. Oba postupy použít kryoprotektantů s nemrznoucí typu vlastnosti, aby se zabránilo poškození buněk během zmrazování. Jakmile buňky se zmrazí nebo vitrifikovaný, mohou být uloženy do nekonečna ponořením je v tekutém dusíku, extrémně studené kapaliny při teplotě -196 ° C (-321 F). Pro obnovení metabolické aktivity v buňce po rozmrazení, musí být odstraněny toxické cryoprotectants z buňky a normální vodní bilance postupně obnovena jako buňka se vrátí na normální teplotu funkční. Přehled

Přehled
postupy

Kryokonzervace jsou ty, které umožňují buňky, které mají být uloženy na dobu neurčitou pomocí extrémně nízkých teplot pozastavit metabolické aktivity. Existují dva hlavní typy kryoprezervačních řízení: rovnováha (konvenční pomalé tuhnutí) a nerovnovážné nebo ultra-rychlé zmrazení (vitrifikace). Termín vitrification pochází z latinského "skelný" nebo skelný. Oba postupy použít kryoprotektantů s nemrznoucí typu vlastnosti, aby se zabránilo poškození buněk během zmrazování. Jakmile buňky se zmrazí nebo vitrifikovaný, mohou být uloženy do nekonečna ponořením je v tekutém dusíku, extrémně studené kapaliny při teplotě -196 ° C (-321 F). Pro obnovení metabolické aktivity v buňce po rozmrazení, musí být odstraněny toxické cryoprotectants z buňky a normální vodní bilance postupně obnovena jako buňka se vrátí na normální teplotu funkční.
Cell- Specifické faktory

postup používaný k Cryopreserve buňky nebo tkáně, závisí na mnoha faktorech, včetně velikosti buňky, buněčné množství tekutiny (cytoplasma) a složitosti buňky (jedna buňka nebo tkáň). Buňky s velkým množstvím cytoplazmy, jako jsou vejce obtížnější Cryopreserve než buňky s jen zbytkovou cytoplazmě jako spermií. Kryokonzervace ovariální tkáně je náročné, protože alespoň tři různé typy buněk, různé velikosti jsou přítomny v ovariální tkáni, z nichž každý má různé optimální zamrznutí potřeby. Pomalé zmrazení protokoly byly s úspěchem s různými typy buněk. Vitrifikace je v současné době nejúčinnější s jednou buňkou zmrazování a méně efektivní s tkání, ale probíhá výzkum pro optimalizaci vitrification tkání.
Role kryoprotektantů

Cytoplazma buňka obsahuje vodu, která se mění na ledových krystalů na tuhnutí. Při tvorbě ledu uvnitř buňky, buňka se kousky a umírá. Z tohoto důvodu, tekutina v buňce musí být odstraněny před dosažením teploty pod bodem mrazu, aby nedošlo k poškození buněk. Různé druhy tekutin nemrznoucí (cryoprotectant) mohou být použity k dehydrataci buňky před zmrazením včetně glycerolu, propandiol, dimethyl-sulfoxde (DMSO), ethanol a cukry, jako je sacharóza a trehalóza. Optimální rychlost chlazení (a rozmrazování), závisí na typu použitého cryoprotectant a na charakteristice buňky nebo tkáně, která má být (nebo to bylo) zmrazená. Cryoprotectants jsou toxické pro metabolismus buněk, takže buňky expozice kryoprotektantů v teplejších metabolických teplotách musí být minimalizované, nebo raději. Při rozmrazování nebo ohřívání buňky, musí cryoprotectants být kompletně odstraněn z buňky před metabolická aktivita se obnoví.
Equilibrium Versus nerovnovážných kryokonzervace řádu

rychlost zmrazování závisí na tom, zda zmrazení protokol je rovnováha nebo non-equilbrium bázi. Pro řízení rovnováhy typu, je optimální rychlost zmrazení dosaženo, pokud existuje rovnováha mezi mírou u kterého buňka je dehydratovaná vody a míra, v níž voda vně buňky je transformován na ledovou fázi. Tato rovnováha nebo pomalu-freeze protokoly obvykle trvat několik hodin dokončit a počítač používá ke spuštění programovatelná rychlost mrazák, aby se zmrazení sazby jsou přesně podle potřeby. Je typicky "hold" krok protokolu u začátku, aby ruční vytvoření spouštěče ledových krystalů nebo "náletových" v tekutině vně buněk.

Zeskelnění, zcela odlišný přístup k zmrazení, že nespoléhá na rampách a dosažení rovnováhy mezi dehydratace a ledových krystalů se používá. Vitrifikace je tak velmi rychlá, že není dostatek času na ledu a buněčná tekutina je převeden přímo do sklivce nebo skleněné fáze, aby nedošlo k poškození buněk. Programovatelná rychlost mrazničky nejsou nutné, protože buňka je přímo ponořila do velmi chladného kapalného dusíku, k dosažení okamžité skelného stavu.
Slow-Freeze Postup

Prvním krokem pomalé zmrazení postup je vystavit buňky ochranném v postupném postupným způsobem pomalu umožnit ustavení rovnováhy buňky se v ochranném při uvolnění vody. Poté, co buňky byly vymazány většiny buněk vody, jsou buňky v ochranném kapaliny umístěny do nádoby z nějakém druhu, jako plastického vlákna, skleněné ampule nebo plastové vial.The objem kapaliny v okolí buňky pro pomalé zmrazení je obvykle nižší než lžičkou a může být pouze několik kapek. Pre-označený kontejner je naplněn, uzavřen a dát do mrazáku, programovatelný, které se pomalu snižuje teplotu v kontejneru po dobu několika minut nebo hodin, velmi nízké teploty. Po několika minutách chlazení, musí startér ledové krystalky se tvoří uvnitř kontejneru "naočkování" kontejner. Setí se provádí pomocí nástroje (např. kleště), které byly předem chladit v tekutém dusíku na dotek nádobu a způsobit ledových krystalů. Tato startovací krystal zahájí řízené ledových krystalů na jednom místě, v bezpečné vzdálenosti od buněk. Jakmile setí je kompletní, zbytek se do chladicích rampy pokračovat. Když je nádoba dosáhne teploty mezi -30 a -85 C, může kontejner obsahující buňky se vrhl přímo do tekutého dusíku dokončit chlazení na -196 ° C.
vitrifikaci

Ultra-rychlý nerovnovážné chlazení postupy, jako vitrifikaci použít vyšší koncentrace kryoprotektantů spolu s téměř okamžité zmrazení míry růstu buněk ponořit přímo do tekutého dusíku. Vitrifikace obchází ledem krystalu fáze a přesune vodu přímo do skla jako fáze. Vitrifikace dosahuje stejný koncový bod jako pomalé zmrazování, ale v poměru -3000C/min, ve srovnání s 10C/min nebo více. Pro vitrifikaci, buňky jsou obvykle umístěny na špičce slámy a přebytek ochranném je odstraněn, takže jen tolik, že buňka lpí na kontejneru povrchového napětí, před vrhat do tekutého dusíku. Vzhledem k tomu, zmrazení je tak rychlý, doba expozice kryoprotektantů je mnohem menší, a mnohem vyšší koncentrace kryoprotektantů lze tolerovat buňkou. Oteplování buňky vrátit do normálního metabolismu fungování musí být neuvěřitelně rychlý. Manipulace glazované vzorků je mnohem náročnější, než pomalu zmrazených vzorků, protože i krátká expozice nad teplotu kapalného dusíku, který může začít neplánované oteplování proces a zmrazení, což je škodlivé pro buňky.