Molekulární klonování Protokoly

Molekulární klonování protokoly zahrnují postupy používané pro definování, izolaci a replikaci DNA sekvenci. Tradiční omezení a protokoly vejcovodů klonování zahájit fragmentaci DNA s omezenými endonukleázy (enzymy, které prochází řetězce DNA v restrikčních místech), DNA fragmentu ligation (oprava nespojitostí v molekulách DNA), transfekce (zavedení nukleové kyseliny do buněk těla) a výběr (Možnost výběru jednotlivých genomů pro replikaci). Izolace

protokoly pro izolaci DNA fragmentu, je prvním krokem v molekulární klonování, často zahrnovat polymerázové řetězové reakce (PMR), který používá cykly vytápění a chlazení pro zesílení části DNA. K dosažení cíle sekvence velikost, jiné protokoly obsahují DNA ultrazvuku, reakce enzymatické štěpení a používání chemicky syntetizovaných oligonukleotidů. Tyto protokoly se liší v závislosti na velikosti a množství izolované DNA potřebné.
Podvaz

Protokoly pro podvázání zahrnovat použití enzym, DNA ligázy připojit molekuly DNA spolu s kovalentní vazba. Protokol určuje kombinace fragmentů DNA, klonování vektor, ligační vyrovnávací paměti na DNA ligázy a sterilizované vody na mikrozkumavky a inkubace přes noc při teplotě 4 stupňů Celsia.
Transfekce

Protokoly pro transfekci nebo infuzí DNA do buňky pomocí nevirových prostředky, často zahrnují vstřikování DNA přímo do buněčné cytoplazmy. Jiné metody zahrnují použití chemických činidel, jako je například fosforečnan vápenatý a lipidů, dodat transfekce komplex přes buněčnou membránu. Tato metoda testuje účinky genové modifikace na fungování specifických genů.
Výběr

výběr, nebo screening, protokoly určit, které buňky úspěšně proběhla DNA vložku a uveďte které buňky potřebují izolaci. Centrifugační sklizně buněk, které obsahují transfekované DNA, které se pak inkubuje v lysozymu (přirozeně se vyskytující enzym) pufru a léčeni zásaditý čistící prostředek, což proteiny a membrány rozpustnost. Použití acetát účelem vysrážení proteinů, centrifugy, tenká filtr DNA obsahující supernatant (rozpustné kapalné zbývající z odstředěním směsi). Supernatant se vysráží polyethylenglykolem, odstředí a suspendovány v cesium chloridu a ethidium bromidu pufru. Se ethidium bromid skvrny DNA podle hustoty, a pomocí dlouhovlnné UV světlo, je nižší-band DNA extrahována s pěti cc injekční stříkačky. Rovnovážného stavu iontové výměny Sloupec oddělí DNA od ethidium bromidu a cesium chloridu, a konečný DNA peleta se suspenduje v roztoku pufru a detekovány elektroforézou v agarózovém gelu.