Intracelulární barvení Protokol pro průtokové cytometrie

Průtoková cytometrie je nástroj, který je užitečný při studiu buněčných proteinů. Využívá vyzařování světla nebo fluorescence proteinů v buňce . Protilátky nebo odsávání oštítkované jako fluorescence se používá ke studiu specifických proteinů . Průtoková cytometrie se používá k diagnostice řady onemocnění, včetně rakoviny , ale je také užitečné při lékařském výzkumu . Upevňovací buňky
Buňky

by měla být stanovena pro udržení stability intracelulárních proteinů . Počet fixaci lze použít jako je například formaldehyd , nebo ledové acetonu. Po fixaci se buněčná membrána musí být permealized , abyprotilátka pro vstup do buňky . Čistící prostředky , jako je Triton , nebo NP- 40 , nebo ledové methanolu může být použit pro otvory v buněčné membráně .
Barvení
buňky

umyjte v blokovacím pufru 0,5 procent bovinní sérový albumin zředí fosfátovým pufrem , BSA /PBS . Buňky jsou inkubovány v blokujícím pufru pro snížení nespecifické vazby . Přidat primární protilátky zředěné v blokujícím pufru a nechá se inkubovat při pokojové teplotě , pro optimální dobu . Umýt blokujícím pufrem .
Analýza

Inkubujte sekundární protilátku , která je označená fluorescenční značky , při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Chcete-li odstranit buňky nevázaných protilátek mytí v blokujícím pufru . Spin buňky na pelety a resuspendujte v PBS a analyzovat na průtokovém cytometru .